利用綜合可視化模型協(xié)助研究

對所有生物樣本進行三維成像，從細胞器到細菌、多層體細胞、組織切片及小的模式生物體。熒光顯微鏡技術(shù)擁有卓越性能，可以用于處理經(jīng)特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)及細胞器。然而，當(dāng)您在樣品內(nèi)對這些目標(biāo)進行成像時，焦平面的上下兩個方向會發(fā)射出熒光，之后會被物鏡捕獲。這種效應(yīng)會使獲得的圖像模糊，降低分辨率。諸如光學(xué)切片等最新的三維成像方法能幫助您從熒光樣品中獲取 出色 的三維圖像。一般而言，三維成像技術(shù)依賴于數(shù)學(xué)算法、光學(xué)硬件或兩者結(jié)合來消除或最大限度地減少非焦平面外的熒光。

在光學(xué)顯微鏡下使用光學(xué)切片的三維成像技術(shù)

去卷積是一種基于數(shù)學(xué)模型的三維成像方法。通過去卷積計算方法將雜散光重新投射回其原點來恢復(fù)模糊圖像。使用焦平面和非焦平面外發(fā)射的所有熒光信號，因此這項光學(xué)切片法非常靈敏且特別適用于微弱熒光樣品和活體細胞成像。借助 ZEN軟件中 去卷積（Deconvolution）模塊，您可以輕松實現(xiàn)寬場熒光圖像的光學(xué)切片。

ApoTome.2 結(jié)構(gòu)照明技術(shù)是基于將柵格結(jié)構(gòu)投影在焦平面同時在一定范圍內(nèi)精確移動。專利算法則是利用至少三張具有不同柵格位置的單幅圖像計算出高解析度的光學(xué)切片圖像。采集組織切片和整個生物的多通道三維圖像，僅需將 ApoTome.2 插入蔡司顯微鏡的視場光闌位置即可獲得令人驚嘆的三維成像效果。

孔徑相關(guān)（Aperture correlation）綜合了結(jié)構(gòu)照明的光效率和 VivaTome 轉(zhuǎn)盤的高速度。激發(fā)光與發(fā)射光通過帶有柵格的旋轉(zhuǎn)圓盤達到共軛平面。由于轉(zhuǎn)盤優(yōu)化了激發(fā)光透射，因此借助普通白光光源便能實現(xiàn)高光效率。來自焦平面的發(fā)射光與 50% 非焦平面的發(fā)射光一起通過轉(zhuǎn)盤并被檢測到。另外 50% 的非焦平面的發(fā)射光則被轉(zhuǎn)盤反射，在捕獲后用于創(chuàng)建第二幅圖像。兩幅圖像相減即可得到光學(xué)切片圖像。因此，您可以使用 VivaTome 的孔徑相關(guān)原理對動態(tài)過程進行高幀率和高對比度成像。

共聚焦顯微鏡技術(shù) 則使用發(fā)射光光程共軛平面內(nèi)的點光源和針孔來抑制非焦平面的雜散光。這項技術(shù)是一款用于較厚樣品成像的強大工具，并能在 z 軸方向上獲得高分辨率。然而，其對于無法發(fā)出足夠亮熒光信號的樣品是個挑戰(zhàn)。蔡司激光掃描顯微鏡 LSM 710 和 LSM 780 配備具有 45% 量子效率的高靈敏探測器。借助出色的信噪比和較短的曝光時間，甚至可實現(xiàn)高難度樣本成像。選用 Cell Observer SD 可以快速、柔和地監(jiān)測活體樣本。此三維成像解決方案采用了轉(zhuǎn)盤技術(shù)，利用轉(zhuǎn)盤上的多個針孔以超高采集速度獲取三維共聚焦圖像。

選擇性激發(fā)是指僅激發(fā)所需焦平面內(nèi)的熒光基團來創(chuàng)建光學(xué)切片。 這可使用 LSM 7 MP 多光子顯微技術(shù)或 LSM 710NOL 和 780NLO 非線性附件來實現(xiàn)。若使用紅外范圍內(nèi)的低能量波長，則需兩個光子激發(fā)熒光基團。因此，主要在激光束密集聚焦的焦平面內(nèi)產(chǎn)成熒光。另外，由于使用了較長的激發(fā)波長，所以降低了散射和光損傷。在無光漂白和無光毒效應(yīng)時，甚至可以獲得 1 毫米深度的圖像。激光層照熒光顯微技術(shù)（LSFM）是另一種使用選擇性激發(fā)的技術(shù)。? 激發(fā)光光路與發(fā)射光光路分離，且僅照射樣本的焦平面。利用 MultiView 成像和培養(yǎng)裝置，Lightsheet Z.1 能夠輕松在長達幾小時甚至數(shù)天內(nèi)監(jiān)測胚胎和器官組織發(fā)育。

三維超高分辨率顯微技術(shù)

超高分辨率結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)（SR-SIM）是一種用于實現(xiàn)三維采集的通用、靈活熒光技術(shù)。相干激光的一個非常精細的相位柵格在樣品上旋轉(zhuǎn)和移動，用以激發(fā)熒光基團。通過樣品結(jié)構(gòu)柵格的干涉條紋，在疊加照明柵格后生成第三種圖案。它會比樣品小結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的精細圖案要寬，因此可由透鏡發(fā)射。然后從這些信息中計算出超高分辨率圖像。通過這種方法可以提高橫向，尤其是軸向的分辨率。ELYRA S.1 和 ELYRA PS.1 能夠?qū)崿F(xiàn)任一傳統(tǒng)熒光基團的三維成像。分辨率是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的兩倍，并通過 z 軸切片實現(xiàn)三維圖像采集。

電子顯微鏡三維成像

掃描電子顯微鏡能以驚人的分辨率對生物微觀結(jié)構(gòu)成像，并與三維成像組合使用。? 使用樹脂包埋樣品，然后在樣品室內(nèi)使用超薄切片機對樣品進行切片。在每次切片后對樣品塊成像，并生成一系列電子顯微鏡圖像，然后組合成最終的三維數(shù)據(jù)集。這一技術(shù)也被稱為系列連續(xù)切片成像技術(shù)（SBF-SEM），蔡司掃描電子顯微鏡可以提供。 MERLIN 3View 和 SIGMA 3View 中充分利用了 Gatan 公司研制的簡便、快捷的 SBF-SEM 技術(shù)。另一種實現(xiàn)方法則是使用聚焦離子束，運用在蔡司 FIB-SEM 系統(tǒng)，用以磨蝕樣本表面并借助 ATLAS 3D 軟件進行重構(gòu)。超薄切片機是一種更快速的方法，而聚焦離子束則能實現(xiàn)更精細的樣品切割。